1、選擇處于對數生長期的細胞，在凍存前一天*換液。將多個培養瓶中的細胞培養液去掉，用0.25% yi 蛋白酶消化。適時去掉yi蛋白酶，加入少量新培養液。用吸管吸取培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。
2、去上清液，加入含20%小牛血清的*培養基，于4℃預冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL之間。
3、將上述細胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要*封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數）。
4、將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內；置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內3～4小時（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態部分存放2小時，蕞后沉入液氮中。
細胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，*取出一只安瓿細胞復蘇培養，觀察生長情況，然后再繼續凍存。
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